这个问题其实挺常见的！结合我之前用ImageJ做Western Blot定量的经验来说，主要可能有以下几种情况导致这种现象出现👇： ### 🔍 **关键原因分析** 1️⃣ **背景扣除差异大** 虽然肉眼觉得内参更亮，但如果在选择ROI（感兴趣区域）时不小心包含了过多背景像素，或者自动阈值设置不合理，软件会把周围较暗的背景也算进目的蛋白的积分范围。这时候即使目标条带本身较淡，总灰度值也可能反超内参📉→🔄（尤其当背景不均匀时特别明显）。 2️⃣ **非线性动态范围压缩** 图像保存为8位格式时会发生伽马校正，人眼对高亮度区域敏感容易产生错觉。比如内参的实际峰值可能已经接近饱和，而目的蛋白处于线性响应区间，但肉眼无法分辨这种细微差别🎨↔️💻。 3️⃣ **选框大小不一致** 手动绘制测量框时若内参的框比目标蛋白的小很多（比如只框了最窄的部分），会导致单位面积内的灰度累积值虚高；反之如果目标蛋白的框过大就会拉低平均值📏≠◻️。 4️⃣ **倒置显影逻辑误解** 要注意在ECL成像系统中，胶片上的黑色对应高信号强度！很多人会误以为白色背景代表高表达，实际上深色条带才是强信号💥。如果误将反相模式当作正常模式分析，就会出现数值与视觉完全相反的结果。 --- ### ✅ **解决方案建议** ✔️ **标准化操作流程**：统一用矩形工具完整包绕整个条带宽度，保持各通道相同的选区尺寸； ✔️ **强制归一化预处理**：在ImageJ中使用`Process > Subtract Background`功能进行背景扣除； ✔️ **检查直方图分布**：通过Analyze>Histogram确认信号是否溢出（Peak超过255说明过曝）； ✔️ **交叉验证法**：同时测量同一张膜上的其他对照组样本，观察比值稳定性。 --- ### 📌 **典型误区提醒** ⚠️ 不要直接比较原始灰度绝对值！必须用`目标蛋白灰度值 / 内参灰度值`来计算相对表达量，这样才能消除上样量差异带来的误差。如果遇到异常结果，建议重新加载图片后盲测（隐藏标签的情况下分析），避免主观判断干扰数据解读~
